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《细胞工程》系统地介绍了细胞工程的基础理论、基本技术和**研究成果。《细胞工程》共分为三篇17章，**篇为细胞工程基础，主要概述了细胞工程的研究内容、发展简史及应用前景，细胞工程实验室的组成及无菌操作技术；第二篇为植物细胞工程，主要包括植物组织与细胞培养的基本原理，植物离体无性繁殖和脱病毒技术，植物细胞培养和次生代谢产物生产，植物原生质体培养和体细胞杂交技术，花药和花粉培养及单倍体育种，植物的胚胎培养，植物体细胞无性系变异与突变体的筛选，植物种质资源的离体保存及植物的遗传转化技术；第三篇为动物细胞工程，主要包括动物细胞培养、细胞融合技术，胚胎工程，动物干细胞技术，转基因动物及动物染色体工程。各章依循基本原理、基本技术、生产实践应用、**研究成果及操作实例的格局编写，注重突出具体的实践操作和工艺技术。各章附有思考题以便于读者自学和掌握有关内容。

目录

**篇 细胞工程基础

**章 绪论 2

**节 细胞工程的研究内容 2

第二节 植物细胞工程发展简史 3

第三节 动物细胞工程发展简史 7

第二章 细胞工程实验室组成及无菌操作技术 12

**节 细胞工程实验室组成 12

第二节 无菌操作技术 17

第三节 培养基组成及其配制 22

第四节 实验室生物安全 32

思考题 33

第二篇 植物细胞工程

第三章 植物组织与细胞培养的基本原理 36

**节 植物细胞的全能性 36

第二节 植物细胞的分化 37

第三节 植物体细胞胚胎发生与人工种子 51

思考题 60

第四章 植物离体无性繁殖和脱病毒技术 61

**节 植物离体无性繁殖技术 61

第二节 植物脱病毒技术 71

第三节 试管苗生产成本核算 80

思考题 84

第五章 植物细胞培养和次生代谢产物生产 85

**节 植物单细胞培养技术 85

第二节 植物细胞的大规模培养 89

第三节 植物细胞生物反应器 96

第四节 植物细胞培养生产次生代谢产物 100

思考题 108

第六章 植物原生质体培养和体细胞杂交 109

**节 原生质体的分离和纯化 109

第二节 原生质体的培养 118

第三节 植物体细胞杂交 125

附：相关培养基的配方(柑橘) 135

思考题 136

第七章 植物花药和花粉培养及单倍体育种 137

**节 花药与花粉培养 137

第二节 单倍体育种 158

思考题 161

第八章 植物胚胎培养 163

**节 胚培养 163

第二节 胚乳培养 169

第三节 胚珠和子房培养 174

第四节 离体授粉与离体受精 177

思考题 182

第九章 植物体细胞无性系变异与突变体的筛选 183

**节 植物体细胞无性系变异 183

第二节 植物体细胞无性系突变体的筛选 187

思考题 192

第十章 植物种质资源的离体保存 194

**节 植物种质资源的常温限制生长保存 195

第二节 植物种质资源的低温保存 196

第三节 植物种质资源的超低温保存 197

思考题 204

第十一章 植物的遗传转化技术 205

**节 植物遗传转化的受体系统 205

第二节 植物遗传转化方法 207

第三节 转基因植株再生及其检测 214

第四节 转基因植物的研究成果及安全性 219

思考题 224

第三篇 动物细胞工程

第十二章 动物细胞培养技术 226

**节 体外培养动物细胞的生物学特性 226

第二节 动物细胞体外培养技术 232

第三节 培养细胞常规检查和特性鉴定 248

第四节 细胞同步化 256

第五节 器官培养 258

思考题 260

第十三章 动物细胞融合 261

**节 细胞融合的基本概念与方法 261

第二节 杂交细胞的筛选 264

第三节 融合细胞的克隆化培养 266

第四节 细胞融合的应用 267

第五节 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 269

思考题 276

第十四章 胚胎工程 277

**节 胚胎移植技术 277

第二节 胚胎冷冻保存技术 288

第三节 体外受精技术 292

第四节 动物克隆技术 301

第五节 动物性别控制技术 310

思考题 315

第十五章 动物干细胞技术 316

**节 干细胞概论 316

第二节 ES/EG细胞培养建系技术 320

第三节 ES/EG细胞体外诱导分化 326

第四节 ES/EG细胞技术的应用 329

思考题 331

第十六章 转基因动物 332

**节 转基因技术概述 332

第二节 转基因动物的常用技术 333

第三节 转基因动物的鉴定 341

第四节 动物转基因技术的应用 345

思考题 348

第十七章 动物染色体工程 349

**节 染色体变异 349

第二节 动物的倍性育种 351

第三节 染色体的显微操作技术 357

第四节 人工染色体 359

思考题 364

参考文献 365

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**篇 细胞工程基础

　　**章 绪论

　　细胞工程（cytotechnology）是指以生物细胞或组织为研究对象，按照人们的意愿进行工程学操作，从而改变生物性状，以获得生物产品，为人类生产和生活服务的科学。细胞工程是现代生物技术的一个重要分支，包括植物细胞工程（plant cell engi-neering）和动物细胞工程（animal celle ngineering）。根据研究水平，分为组织水平、细胞水平、细胞器水平和分子水平等不同研究层次。

　　**节 细胞工程的研究内容

　　根据操作对象不同，细胞工程的研究内容可分为七大类，分述于下。

　　一、器官、组织和细胞培养

　　器官、组织和细胞培养（organ，tissue and cellculture）是指对生物体的器官、组织或细胞进行离体培养，研究其所需培养系统和条件，如有机营养、无机营养、激素、活性物质、培养基的酸碱度，温（湿）度，光照等营养条件和刺激因素；研究器官、组织和细胞的形态发生规律；或使之形成组织或有机体的技术。

　　二、原生质体培养

　　原生质体培养（protoplast culture）是指将植物细胞去壁使之游离成原生质体，在适宜培养条件下使其细胞壁再生，并进行细胞分裂分化，形成完整个体的技术。

　　三、植物胚胎培养

　　植物胚胎培养（plant embryo culture）是指使胚或具胚器官（如子房、胚珠等）在离体无菌条件下发育成正常植株的技术。

　　四、动物胚胎工程

　　动物胚胎工程（animal embryo engineering）是指以动物胚胎为对象而产生的一系列技术操作，如胚胎移植（embryo transfer），胚胎冷冻（embryo freezing），体外受精（in vitro fertilization，IVF），克隆动物（cloned animal）和性别控制（sex control）等。

　　五、转基因动植物

　　转基因动植物（transgenic animal and plant）是指将人们需要的目的基因导入受体动植物基因组中，使外源基因与其发生整合，并随细胞分裂而增殖，在动植物体内表达，并稳定地遗传给后代。

　　六、胚胎干细胞

　　胚胎干细胞（embryo stem cell，ES）是指胚胎或原始生殖细胞经体外抑制分化培养后，筛选出的具有发育全能性的细胞。ES细胞可以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞，甚至形成复杂的组织或器官。ES的研究将在未来的人体发育，基因功能，药物开发，细胞、组织和器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源。

　　七、染色体工程

　　染色体工程（chromosome engineering）是指借助于物理和化学等方法，使生物染色体数目、结构和功能发生改变的技术。

　　第二节 植物细胞工程发展简史

　　1902年，德国植物学家Haberlandt根据Schwann和Schleiden创立的细胞学说提出了细胞的全能性（totipotency）理论，并开创了细胞工程学说的探索和研究，至今已有一百多年的历史。可概括为以下三个阶段。

　　一、探索阶段（1902—1929年）

　　1902年，Haberlandt提出了细胞全能性学说，预言植物细胞在适宜条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。为了证实这一观点，他用野芝麻（Lamium barbatum Sieb. Et Zucc）和紫鸭跖草（Commelina communis）等植物的栅栏组织和表皮细胞进行离体培养，由于受当时的技术条件和研究水平限制，仅在栅栏组织中看到了细胞的生长、细胞壁的加厚等，而没有观察到细胞分裂。Haberlandt实验失败的原因现在看来主要在于两点：**，他所选用的实验材料都是已经高度分化了的细胞；第二，所用的培养基过于简单，特别是培养基中没有包含诱导成熟细胞分裂所必需的生长激素。然而，作为植物组织培养的先驱者，Haberlandt的贡献在于首次进行了离体细胞培养的实验，对植物组织培养的发展起了先导作用。1904年，Hannig在加有无机盐和蔗糖溶液的培养基中，培养萝卜和辣根的幼胚，得到了充分发育的胚并提前萌发成小苗，这是离体培养的**个成功例子。1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道离体培养根尖获得成功，这是有关根培养的*早实验。并在含有无机盐，葡萄糖和琼脂的培养基上使豌豆、玉米、棉花茎尖、根尖培养成苗。1925年和1929年，Laibach将由亚麻（Linum usitatissimum ）种间杂交形成的幼胚在人工培养基上培养获得成功并得到杂种，证明了胚培养在远缘杂交中利用的可能性。

　　二、培养技术与理论的建立与发展阶段（1930—1959年）

　　1934年，美国植物生理学家White由培养番茄根建立了**个活跃生长的无性繁殖系，并在**个人工合成培养基上将番茄根培养了30年之久，证明了根的无限生长特性。在此基础上，1937年，White研配了综合培养基（White培养基），并发现了B族维生素（吡哆醇、硫胺素、烟酸）和生长素——吲哚乙酸对离体培养的促进作用。几乎与此同时（1937—1938年），法国学者Gautheret和Nobecourt在三毛柳、黑杨和胡萝卜根形成层的培养过程中成功地得到了愈伤组织，同时也发现B族维生素和生长素对形成层组织生长的显著促进作用。因此，White、Gautheret和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。现在所用的若干培养方法和培养基，原则上都是这三位学者在这一时期所建立的方法和培养基演变的结果。

　　20世纪40—50年代初期，活跃在植物组织培养领域里的研究者以Skoog为代表，研究的主要内容是利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的生长和芽的形成。

　　Skoog（1944）和崔澂等（1948）在烟草离体培养中发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例是芽和根形成的控制主要条件之一。1941年，Overbeek等首次把椰子汁作为附加物引入到培养基中，使曼陀罗的心形期幼胚能够离体培养至成熟。到20世纪50年代初，由于Steward等在胡萝卜组织培养中也使用了这一物质，从而使椰子汁在组织培养的各个领域中都得到了广泛应用。

　　20世纪50年代以后，植物组织培养的研究日趋繁荣，10年当中引人注目的进展主要有：

　　1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖分生组织离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。1953—1954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。方法是把万寿菊（Tagetes erecta）和烟草（Nicotiana tabacum ）的愈伤组织转移到液体培养基中，放在摇床上振荡，使组织破碎，形成由单细胞和细胞聚集体组成的细胞悬浮液，然后通过继代培养进行繁殖。1955年，Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素，并把它定名为激动素（kinetin，KT）。1957年，Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念，指出根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比例的函数，通过改变培养基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化。1958—1959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式，该实验**次证实了植物细胞的全能性。

　　综上所述，在这一发展阶段中，通过对培养条件和培养基成分的广泛研究，特别是对B族维生素、生长素和细胞分裂素在组织培养中作用的研究，已经实现了对离体细胞生长和分化的控制，从而初步确立了组织培养的技术体系，为以后的发展奠定了基础。

　　三、快速发展和实践应用阶段（1960年以后）

　　20世纪60年代以后，随着离体培养技术的不断完善，以及其他生命学科的迅速发展，细胞工程的技术和内容不断得到提高和拓展，并广泛地应用于生产实践。

　　（一）原生质体培养取得重大突破

　　1960年，英国学者Cocking等用真菌纤维素酶和果胶酶分离植物原生质体获得成功，开创了植物原生质体培养和体细胞杂交工作。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不但在理论上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上可以为外源基因的导入提供理想的受体材料。1972年，Carlson利用诱导剂甘露醇和硝酸盐培养两个不同种的粉蓝烟草（Nicotiana glauca）和郎氏烟草（N.Langsdorfii）的原生质体时，获得了两种原生质体的融合体，得到了细胞杂种。随后由加籍华人高国楠在聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）的诱导下，使大豆和粉蓝烟草（科间）融合成功，而且得到3%的异核体。1974年，Bonne和Eriksson成功地完成了细胞器（叶绿体）的摄入。将具有叶绿体的海藻和不具有叶绿体的胡萝卜根原生质体，在PEG诱导下融合成功。观察到16%的活胡萝卜原生质体中，含一至多个叶绿体。试验证明原生质体是引入外源遗传物质的极好材料，为基因工程奠定了良好基础。1978年，Melchers进行了马铃薯和番茄的融合实验，获得了**个属间体细胞杂种植株。1981年，Zimmermann开发了利用改变电场诱导原生质体融合的电融合法。1985年，Fujimura获得了**例禾谷类作物——水稻原生质体培养再生植株。1986年，Spangenbeng获得了甘蓝型油菜单个原生质体培养再生植株。Harris等（1989）、Ren等（1990），在小麦上也获得了原生质体再生的相继成功，将植物原生质体研究推向新的阶段。

　　到目前为止，已在多个物种中获得了原生质体，并诱导了不同种间、属间，甚至科间及界间的细胞融合，获得了一些具有优良特性或抗性的种间或属间杂种。

　　（二）花药培养及单倍体育种

　　1964年，印度学者Guha和Maheshwari离体培养毛叶曼陀罗的花药，获得了世界上**株花粉单倍体植株，极大地促进了植物单倍体育种技术及通过单倍体育种来加速常规杂交育种的速度。1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。由于单倍体在突变选择和加速杂合体纯合过程中的重要作用，这一领域的研究在20世纪70年代得到了迅速发展。1970年，Kameyah和Hinata用悬滴法培养甘蓝×芥蓝的杂种一代成熟的花粉，获得单倍体再生植株。1974年，我国科学家育成了世界上**个作物新品种——烟草品种“单育1号”，之后又育成水稻“中华8号”、小麦“京华1号”等一批优良品种。目前，世界上已有约300种植物成功地获得花粉植株，其中，包括很多种重要的栽培植物，如烟草、水稻和小麦等，并在生产上大面积推广种植。

　　（三）植物脱毒和快繁技术得到广泛应用

　　早在1943年，White就发现植物生长点附近的病毒浓度很低，甚至无病毒，利用茎尖分生组织培养可脱去病毒，获得脱毒植株。1960年，Morel用兰花茎尖离体培养，既脱除了兰花的病毒，又建立了兰花的快速繁殖体系，繁殖效率极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，带动了欧洲、美洲和东南亚许多国家兰花工业的兴起。随后，植物微繁技术和脱毒技术得到迅速发展，实现了试管苗产业化，取得了巨大的经济与社会效益。目前，用这种方法繁殖的兰花至少已有35个属150余种。除兰花外，目前利用组织培养脱毒技术生产脱毒苗，已在很多观赏植物和经济作物（如马铃薯、甘薯、甘蔗、草莓、大蒜等）实现了工厂化生产。目前，在世界上，已建立起许多年产百万苗木的组培工厂，已成为一个新兴产业，组培苗市场已国际化。植物脱毒技术和离体快速繁殖方法已在观赏植物、园艺植物、经济林木、无性繁殖作物上广泛应用。

　　（四）次生代谢产物的生产

　　植物细胞中存在着许多难以人工合成但具有显著药用或经济价值的特殊物质。但由于植物资源缺乏以及环保的

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序言

书籍介绍

杨淑慎主编的《细胞工程(普通高等教育十一五规划教材)》系统地介绍了细胞工程的基础理论、基本技术和最新研究成果。全书共分为三篇17章，第一篇为细胞工程基础，主要概述了细胞工程的研究内容、发展简史及应用前景，细胞工程实验室的组成及无菌操作技术；第二篇为植物细胞工程，主要包括植物组织与细胞培养的基本原理，植物离体无性繁殖和脱病毒技术，植物细胞培养和次生代谢产物生产，植物原生质体培养和体细胞杂交技术，花药和花粉培养及单倍体育种，植物的胚胎培养，植物体细胞无性系变异与突变体的筛选，植物种质资源的离体保存及植物的遗传转化技术；第三篇为动物细胞工程，主要包括动物细胞培养、细胞融合技术，胚胎工程，动物干细胞技术，转基因动物及动物染色体工程。各章依循基本原理、基本技术、生产实践应用、最新研究成果及操作实例的格局编写，注重突出具体的实践操作和工艺技术。各章附有思考题以便于读者自学和掌握有关内容。

《细胞工程(普通高等教育十一五规划教材)》可作为生物工程、生物技术及生物科学等生物类专业本科生和研究生的教材及相关专业教师和科技人员的参考书。