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《基因工程》第二版为 精品课程建设教材、 精品资源共享课教材，与教材配套有慕课视频可供学习。

本教材主要内容包括三部分：一是基因工程的基本原理与基本技术，涉及工具酶和基因工程载体及常用的基因表达系统，目的基因获取、制备、扩增、导入与鉴定的各种方法。二是基因工程用于功能基因组学研究的技术，包括基因表达谱研究技术、全基因组化学诱变和转座子饱和诱变技术、基因敲除与基因敲减技术、过表达和异位表达技术、染色质沉淀等基因相互作用研究技术等，第二版还大篇幅增加了TALEN和CRISPR基因编辑技术的发展历史和 进展。三是基因工程在工农业生产和医学研究中的应用，包括转基因植物、转基因动物的制备与应用，转基因安全评价与监管，基因治疗的原理、策略与研究进展。

本教材可用作 高等院校及科研院所生物科学、生物技术、生物工程及基础医学和制药专业的本科生、研究生及科研人员学习的教材和参考书，也可作为对转基因技术和基因工程感兴趣的其他领域人士科普学习的参考书。

1基因工程概述 001

1.1基因工程的概念与基本流程 001

1.1.1基因工程的概念 001

1.1.2基因工程的基本流程 002

1.2基因工程的发展简史 003

1.2.1基因工程诞生的背景 003

1.2.2基因工程的诞生 004

1.2.3基因工程的发展 006

1.3基因工程的研究意义和应用 007

1.3.1基因工程在功能基因组学研究中的应用 007

1.3.2基因工程在工业领域的应用 008

1.3.3基因工程在农业领域的应用 009

1.3.4基因工程在医药领域的应用 011

本章小结 013

复习题 013

2基因工程工具酶 014

2.1限制性核酸内切酶 014

2.1.1限制性核酸内切酶的发现和种类 014

2.1.2限制性核酸内切酶的命名 016

2.1.3限制性核酸内切酶的特征 016

2.1.4限制性核酸内切酶的同尾酶 018

2.1.5影响限制性核酸内切酶酶切反应的因素 020

2.1.6限制性核酸内切酶酶切位点的引入与消失 022

2.2DNA连接酶 023

2.2.1DNA连接酶的作用 023

2.2.2不同末端的连接策略 025

2.2.3影响DNA连接反应的因素 027

2.3DNA聚合酶类 029

2.3.1大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 029

2.3.2Klenow大片段酶 030

2.3.3耐热的DNA聚合酶Taq 030

2.3.4T4噬菌体DNA聚合酶 031

2.3.5逆转录酶 032

2.4碱性磷酸酶 033

2.4.1碱性磷酸酶防止载体自连 033

2.4.2获得5′末端磷酸基团标记的探针 036

2.5末端脱氧核苷酸转移酶 036

2.6其他工具酶 037

2.6.1Ⅱs型限制性核酸酶 038

2.6.2Cas核酸内切酶 039

2.6.3Dicer酶 039

2.6.4重组酶 040

本章小结 043

复习题 043

3基因工程载体 044

3.1克隆载体 044

3.1.1质粒载体 045

3.1.2噬菌体载体 053

3.1.3黏粒载体 057

3.1.4人工微小染色体 058

3.2表达载体 060

3.2.1原核表达载体 060

3.2.2真核表达载体 072

本章小结 076

复习题 076

4目的基因的获取与制备 077

4.1从基因文库获取目的基因 078

4.1.1基因组文库的构建与筛选 078

4.1.2cDNA基因文库的构建与筛选 083

4.2电子克隆法获取目的基因 092

4.2.1利用EST数据库进行电子克隆 093

4.2.2利用基因组数据库进行电子克隆 093

4.2.3全长cDNA 的判断 094

4.2.4电子克隆基因的生物信息学分析 095

4.3PCR 获取与扩增目的基因 095

4.3.1常规PCR 095

4.3.2反向PCR 102

4.3.3反转录PCR 104

4.3.4实时荧光定量PCR 105

4.3.5多重PCR 110

4.3.6巢式PCR 113

4.3.7不对称PCR 113

4.3.8RACE?PCR 114

4.3.9原位PCR 114

4.4通过蛋白质工程改建目的基因 116

4.4.1蛋白质工程的概念 116

4.4.2蛋白质工程的定点突变技术 117

4.4.3蛋白质工程的定向进化技术 121

本章小结 123

复习题 124

5目的基因导入受体细胞的方法125

5.1把目的基因导入大肠杆菌 126

5.1.1自然条件下的转化过程 126

5.1.2感受态受体细胞的选择 128

5.1.3外源目的基因转化进入大肠杆菌细胞的方法 129

5.1.4外源基因通过噬菌体转导进入受体细胞 131

5.2把目的基因导入酵母细胞 133

5.2.1聚乙二醇介导的酵母转化 133

5.2.2金属阳离子介导的酵母转化 134

5.3把目的基因导入植物细胞 134

5.3.1DNA直接转移法 135

5.3.2农杆菌Ti质粒载体介导法 137

5.4把目的基因导入动物细胞 141

5.4.1外源基因导入离体培养的动物细胞 142

5.4.2外源基因导入在体动物细胞 144

本章小结 147

复习题 147

6阳性转化子的鉴定148

6.1遗传表型检测法 148

6.1.1利用载体提供的表型特征筛选和鉴定重组DNA分子 149

6.1.2利用外源目的基因本身的序列提供的表型特征筛选 153

6.2酶切电泳检测 155

6.2.1凝胶电泳检测筛选 155

6.2.2限制性核酸内切酶酶切分析筛选 156

6.3核酸分子杂交 158

6.3.1Southern印迹杂交 159

6.3.2Northern印迹杂交 164

6.3.3蛋白质印迹分析 167

6.4PCR扩增鉴定筛选 168

6.5DNA序列测定 169

6.5.1Sanger双脱氧末端终止法 169

6.5.2化学降解法 171

6.5.3自动测序法 172

6.5.4二代测序技术 173

6.5.5三代测序技术 176

6.5.6单细胞测序技术 179

6.5.7高通量测序在组学研究中的应用 180

本章小结 184

复习题 184

7基因工程在基因功能研究中的应用185

7.1基因的表达谱研究技术 185

7.1.1胚胎原位杂交技术 186

7.1.2胚胎抗体染色技术 190

7.1.3基因芯片技术 194

7.2基因的突变研究技术 199

7.2.1化学诱变 199

7.2.2转座子全基因组诱变 200

7.3基因敲除技术 204

7.3.1 基因敲除技术 204

7.3.2条件基因敲除技术 209

7.4基因编辑技术 214

7.4.1锌指核酶基因敲除技术 215

7.4.2TALEN基因编辑技术 218

7.4.3CRISPR基因编辑技术 221

7.5基因敲减技术 241

7.5.1RNA干扰技术 241

7.5.2Morpholino干扰技术 244

7.6基因过表达与异位表达技术 246

7.6.1GAL4UAS系统的构建 247

7.6.2GAL4UAS定时开启系统 248

7.7基因的相互作用研究技术 249

7.7.1凝胶迁移率阻滞技术 250

7.7.2染色质免疫沉淀技术 250

7.7.3酵母双杂交技术 253

7.7.4免疫共沉淀技术 256

本章小结 257

复习题 258

8转基因植物259

8.1转基因植物研究和生产现状 260

8.1.1转基因植物的研究概况 260

8.1.2抗除草剂转基因作物 261

8.1.3抗虫转基因作物 263

8.1.4提高作物产量和品质的转基因作物 266

8.1.5其他转基因作物 268

8.1.6植物生物反应器 273

8.2转基因植物的筛选与检测 275

8.2.1报告基因 275

8.2.2分子生物学检测方法 277

8.3转基因植物的安全性 278

8.3.1转基因安全性的由来 279

8.3.2转基因安全性的争论 279

8.3.3转基因作物安全性评价程序 284

8.3.4转基因作物安全性的监管 285

本章小结 287

复习题 287

9转基因动物288

9.1动物转基因技术 289

9.1.1显微注射法 289

9.1.2逆转录病毒感染法 294

9.1.3胚胎干细胞介导法 297

9.1.4体细胞核移植法 299

9.2转基因动物的筛选与检测 305

9.2.1报告基因 305

9.2.2分子生物学检测方法 306

9.2.3转基因动物整体表型的观察 309

9.3转基因动物的现状与应用 309

9.3.1转基因动物的现状 309

9.3.2转基因动物在基因功能研究中的应用 310

9.3.3转基因技术在动物育种中的应用 311

9.3.4转基因动物在医学研究中的应用 313

9.3.5动物生物反应器 314

本章小结 318

复习题 318

10基因治疗319

10.1基因治疗的概念与策略 319

10.1.1基因治疗的途径与策略 320

10.1.2基因治疗的基本程序 321

10.1.3基因治疗的发展、现状与问题 323

10.2基因治疗的载体 328

10.2.1逆转录病毒载体 328

10.2.2腺病毒载体 329

10.2.3腺相关病毒载体 332

10.2.4单纯疱疹病毒载体 333

10.2.5非病毒载体 335

10.3重要疾病的基因治疗 336

10.3.1遗传病的基因治疗 336

10.3.2肿瘤的基因治疗 342

10.3.3艾滋病的基因治疗 358

本章小结 367

复习题 367

参考书目与文献368

袁婺洲，湖南师范大学生命科学院教授，博士生导师。1988年毕业于北京师范大学生物学系，1994年获湖南农业大学遗传学专业博士学位。美国密西根大学博士后，英国伦敦大学学院 研究学者。自1994年起在湖南师范大学生命科学学院从事《基因工程》和《遗传学》等课程的教学工作。主持《基因工程》 精品课程及 精品资源共享课程各1项，湖南省精品在线开放课程1项。主编教材2部，合编教材3部。获“ 1届全国多媒体课件大赛”二等奖1项，湖南师范大学教学成果一等奖2项，教学奖5项。主编的《基因工程》教材获2012年中国石油和化学工业出版物奖（教材奖）二等奖。研究方向是利用动物模型研究人类心脏发育及心血管疾病基因的功能与调控机制。主持 自然科学基金项目5项、 新世纪人才支持计划1项及省级课题多项。在 外杂志发表研究论文120多篇，合作出版专著4部。获湖南省科技进步一等奖1项、湖南省自然科学奖一等奖1项、第五届湖南省青年科技奖1项、湖南省“芙蓉百岗明星”1项。

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